| Congresso Brasileiro de Microbiologia 2023 | Resumo: 655-2 | ||||
Resumo:Otimizar o metabolismo de xilose na levedura Saccharomyces cerevisiae utilizando a engenharia genética tem se mostrado fundamental para o sucesso das biorrefinarias de segunda-geração (2G), sobretudo as que se baseiam no uso da biomassa de cana-de-açúcar visando a produção de etanol 2G. Isso ocorre porque a xilose é o segundo açúcar mais abundante nos hidrolisados lignocelulósicos, e S. cerevisiae não é capaz de fermentar essa pentose. Entre as modificações genéticas necessárias, um dos aspectos-chave é melhorar o transporte da xilose para o interior das células, sabidamente um dos fatores limitantes para a fermentação eficiente do açúcar por esta levedura. Embora estratégias de sobre-expressão das permeases endógenas tenham sido propostas para aumentar o transporte de xilose, S. cerevisiae apresenta um sistema de regulação pós-traducional que leva à endocitose e degradação dos transportadores de membrana, mecanismo que envolve a ubiquitinação de resíduos de lisina nos domínios citosólicos amino e/ou carboxi-terminal dos transportadores. Portanto, é necessário considerar essa regulação no desenvolvimento de estratégias de modificação genética visando melhorar o transporte de xilose nessa levedura. Além disso, estudos recentes revelaram que o transportador Hxt1 de S. cerevisiae, que possui alta capacidade de transporte de xilose, é endocitado e degradado pelas células na ausência de glicose, mecanismo que envolve a porção amino-terminal da permease. Devido a isso, a endocitose do Hxt1 pode prejudicar o consumo de xilose em S. cerevisiae quando apenas a pentose está presente como substrato. Nesse contexto, o presente trabalho teve como objetivo modificar geneticamente uma linhagem industrial de S. cerevisiae derivada da CAT-1 capaz de utilizar xilose (cepa MP-C5), sobre-expressando o transportador endógeno Hxt1 truncando sua porção amino-terminal, a fim de fixá-lo na membrana das células, evitando sua degradação, e assim melhorar a metabolização de xilose. Foram utilizadas abordagens baseadas em PCR e recombinação homóloga para construir a cepa MP-C5H1 (PADH1::[4-59Δ]HXT1), e as duas linhagens (MP-C5 e MP-C5H1) tiveram também os transportadores Hxt1 fusionados à proteína GFP (Green Fluorescent Protein). Em análises por microscopia confocal, a cepa parental MP-C5 apresentou o sinal do transportador Hxt1-GFP na superfície celular após 2 horas de cultivo em glicose, mas a endocitose ocorreu após 8 horas, com a depleção da glicose, quando o transportador foi visto em vesículas intracelulares. Na presença de xilose como única fonte de carbono, a linhagem MP-C5 não demonstrou fluorescência, indicando a ausência do transportador Hxt1-GFP nas células nessa condição, enquanto a linhagem MP-C5H1 apresentou fluorescência na membrana tanto após cultivo em glicose como em xilose. Por fim, em análises fermentativas, a linhagem com a truncagem do Hxt1 consumiu mais rapidamente a xilose e produziu mais etanol do que a cepa parental. Em conjunto, os resultados aqui apresentados sugerem uma estratégia funcional de estabilização do transportador Hxt1 na membrana de S. cerevisiae e destacam a importância dessa permease para a fermentação eficiente de xilose. A linhagem industrial recombinante desenvolvida (MP-C5H1) poderá agora ser testada em fermentações industriais de hidrolisados lignocelulósicos. Palavras-chave: endocitose, etanol 2G, HXT1, transportador, xilose Agência de fomento:INCT Leveduras: Biodiversidade, preservação e inovações biotecnológicas (Processo CNPq nº. 406564/2022-1); CAPES e CNPq. | |||||